細胞培養(yǎng)支原體污染來源/檢測/預防/去除

一、細胞培養(yǎng)支原體污染來源及主要支原體種類

       支原體（Mycoplasma）是一種大小介于細菌和病毒之間（0.1 - 0.6μm），沒有細胞壁、并獨立生活原核生物，形態(tài)呈高度多形性，呈圓形、絲狀或梨形。由于支原體直徑較小，進行除菌過濾是，約1%的支原體可以直接穿過常規(guī)的0.22μm的微孔除菌濾膜，造成細胞的支原體污染。支原體污染的來源包括：（1）工作環(huán)境的污染，實驗器材帶來的污染；（2）操作者本身的污染（一些支原體在人體是正常菌群）；（3）已受污染的培養(yǎng)基、血清，或用來制備細胞的原始組織或器官的污染；（4）污染支原體的細胞造成的交叉污染。

       目前，已發(fā)現(xiàn)的支原體品種有100多種，但根據(jù)國內(nèi)外相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，大約有二十多種支原體能污染細胞，有的細胞株可以同時污染兩種以上的支原體。以下13種支原體污染在全部支原體污染中所占比例超過99%。（1）M. orale、（2）M.Arginini、（3）M.Hyorhinis、（4）A.Laidlawii、（5）M.Fermentans、（6）M. salivarium、（7）M.pirum、（8）M. hominis、（9）M. agalactiae、（10）M.bovis、（11）M. buccale、（12）M. arthritidis、（13）M. pulmonis。其中尤其是前四種：M.orale（口腔支原體）、M.arginini（精氨酸支原體）、M.hyorhinis（豬鼻支原體）和A.laidlawii（萊氏無膽甾原體）所占污染比例超過95%，前8種占比超過98%。

二、支原體污染對細胞培養(yǎng)的危害

1、支原體污染的普遍性

       支原體污染是細胞培養(yǎng)領(lǐng)域遇到的性問題，據(jù)文獻報道，綜合美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）、美國模式菌種收集中心(ATCC)等機構(gòu)收到的相關(guān)數(shù)據(jù)，世界各國細胞系支原體污染的平均比例為30-60%。該數(shù)據(jù)未統(tǒng)計中國大陸的數(shù)據(jù)，但可以確定，大陸地區(qū)的支原體污染比例與此相當，或更嚴重。

表1.部分國家及機構(gòu)細胞系污染數(shù)據(jù)統(tǒng)計

2、支原體污染的危害

根據(jù)已發(fā)表的支原體污染研究文獻，支原體污染細胞后，幾乎能影響每一個細胞參數(shù)。

（1）支原體污染可能導致細胞染色體的異常和損傷，改變細胞的代謝、生長、形狀、附著。

（2）支原體影響被污染細胞的基因表達。相關(guān)研究表明，支原體污染的細胞系與對照組比較，有多達200個基因表達差異達2倍以上。

（3）導致MTT等細胞毒性實驗結(jié)果嚴重錯誤。支原體對MTT有額外還原作用。

（4）支原體污染能耗盡營養(yǎng)物，促進代謝積累，重度支原體污染導致pH改變。

（5）誘導或抑制細胞因子表達，并改變培養(yǎng)細胞的代謝、增殖特征及形態(tài)。支原體污染可以直接影響L-arginine的代謝

（6）支原體污染可以誘導樹突狀細胞成熟，這對于開展人體免疫細胞的腫瘤治療的影響將是災難性的。

3、支原體污染的隱蔽性

      支原體大小約0.1 - 0.6微米，體積比病毒稍大，輕度到中度的支原體污染不會明顯改變細胞培養(yǎng)液的渾濁度和pH值，也不會導致細胞形態(tài)或生長速度的明顯改變，所以科研人員很難及時發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)的細胞已經(jīng)被支原體污染，進而改變了基因表達譜，顯示虛假的實驗數(shù)據(jù)和實驗結(jié)果。通常情況下，如果不排除支原體污染因素，很多實驗結(jié)果往往缺乏說服力。2013年，*期刊《Nature》明確要求，在涉及細胞培養(yǎng)的科研工作中，必須進行支原體檢測，并排除其影響。

三、支原體污染檢測

1、支原體檢測方法概述

      支原體污染嚴重干擾細胞實驗結(jié)果，檢測有無支原體污染的方法較多，可以根據(jù)自身實驗室條件、檢測方法便捷性等作出選擇。

       ①電子顯微鏡，相差顯微境觀察。用掃描電鏡或透射電鏡，直觀觀察支原體形態(tài)?；蛘咴诩毎囵B(yǎng)瓶內(nèi)預置蓋玻片，接種細胞在蓋玻片上，培養(yǎng)24小時后取出用油鏡觀察。如有支原體，因支原體與細胞在不同平面，可發(fā)現(xiàn)支原體呈現(xiàn)暗色顆粒裝。缺點：設備要求嚴格，檢測成本高，不適合普通實驗室日常常規(guī)檢測。

      ③DNA熒光染色法，利用支原體沒有細胞膜（壁）的特性，用熒光染料Hoechst 33258染色， Hoechst 33258能與支原體DNA結(jié)合著色，在熒光顯微鏡下觀察，呈現(xiàn)綠色小點。缺點：靈敏度太低，當檢測成陽性時，細胞經(jīng)常已經(jīng)嚴重污染。‚

  ④培養(yǎng)法，用支原體培養(yǎng)基大量增殖支原體，是相對可靠的支原體檢測技術(shù)。缺點：耗時長，需要數(shù)周時間才能得到結(jié)果，不適合作為細胞培養(yǎng)液中支原體污染的快速檢測。此外，該方法不能檢測豬鼻支原體，因為豬鼻支原體不能在固體培養(yǎng)基上形成可見的菌落，豬鼻支原體（M.Hyorhinis）約占所有支原體污染的20-50%。

       ⑤PCR法，提取細胞培養(yǎng)液，提取支原體，制備樣品，根據(jù)支原體高度保守的16SrRNA序列設計引物（避免真核細胞或細菌DNA干擾），設置陰性，陽性對照，擴增產(chǎn)物經(jīng)電泳后成像觀察，可識別已發(fā)現(xiàn)的幾乎全部100余種支原體。

       ⑥Quick Cell快速檢測法，拓撲酶環(huán)化支原體DNA，在根據(jù)高保守區(qū)設計的引物引導下，采用特殊等溫DNA擴增酶，61℃條件下，連續(xù)滾環(huán)式擴增支原體DNA 60分鐘，根據(jù)有無支原體污染，隨著擴增進程可目視實驗結(jié)果。

       ⑦化學發(fā)光法，裂解支原體后，有底物情況下，支原體特異性的酶，能將ADP轉(zhuǎn)化成ATP。ATP參與熒光素酶（Luciferase）催化底物熒光素（Luciferin）產(chǎn)生光的過程，所以可以通過催化底物熒光素導致的生物發(fā)光（Bioluminescence）信號來判別支原體DNA存在與否。

      綜上所述，在多種支原體檢測方法中，受實驗條件、實驗時長、便捷性等因素限制，①-④僅在很少情況下得到應用。實際科研工作中，應用的是⑤ PCR支原體檢測法；⑥Quick Cell快速支原體檢測法；⑦化學發(fā)光支原體檢測法。

2、幾種zui常用支原體檢測方法比較

3、支原體檢測策略及方法選擇

①單個方法獨立檢測支原體（正確檢出率80%-99.9%）

      就單個檢測方法及原理而言，“化學發(fā)光法”擁有zui高的正確檢出率（99.9%），用時zui短，應為方法。可選產(chǎn)品為Lonza公司的MycoAlert Plus Mycoplasma Detection Kit (CAT:C4056L1065，價格：約9800元/100次），或李記生物公司的“Quick Cell 支原體發(fā)光法檢測試劑盒（CAT:C4056L1065，價格：1250元/50次）”。

      若受實驗室條件所限沒有配備化學發(fā)光檢測儀，或多功能酶標儀，建議選擇“Quick Cell快速檢測法”，該方法1小時出結(jié)果，避免了PCR法因細胞代謝產(chǎn)物抑制PCR反應導致的假陰性出現(xiàn)，正確檢出率大于99%，對設備幾乎無要求，可目測結(jié)果。產(chǎn)品可選李記生物公司的“Quick Cell支原體快速檢測試劑盒（CAT:C4056L1060，價格：1250元/50次）”。

②多原理支原體檢測策略

      市場在售的所有支原體檢測試劑盒，目前沒有一種可以檢出全部可能的支原體污染，如果從事細胞治療、進行干細胞培養(yǎng)、生產(chǎn)血清、胰酶、培養(yǎng)液工作的科研人員，強烈建議選擇兩種以上檢測方法，確保支原體正確檢出率達到100%，避免關(guān)鍵實驗不必要的損失。

      細胞培養(yǎng)支原體污染是個普遍性問題，污染來源很多，根據(jù)國外生物實驗室的規(guī)范做法，實驗室的支原體檢測要定期進行，一般一個月做一次支原體檢測，可以*時間確定支原體污染情況，顯著降低或避免支原體污染對細胞培養(yǎng)相關(guān)實驗的影響。

四、支原體污染去除

1、支原體污染預防

      根據(jù)可能的支原體污染來源，在體外細胞培養(yǎng)過程中，要嚴格控制環(huán)境污染；嚴格實驗操作；細胞培養(yǎng)基和實驗器材、耗材要保證無菌；在不影響實驗結(jié)果的前提下，可在細胞培養(yǎng)基中加入適量的特定抗生素；發(fā)現(xiàn)支原體污染后，要清除支原體，防微杜漸。

2、支原體污染的去除及預防

      因為支原體沒有細胞壁，一般用于細胞壁合成的抗生素對支原體沒有作用，如青霉素、萬古霉素多粘菌素（polymycin）、利福平、磺胺藥物普遍沒什么效果。對支原體zui有抑制活性及常用于支原體去除的抗生素是四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類及一些氟喹諾酮。在低濃度時，這些抗生素不會產(chǎn)生耐藥性，且對哺乳動物細胞的毒性較小。四環(huán)素和大環(huán)內(nèi)酯能結(jié)合30S和50S核糖體亞基，從而抑制支原體蛋白質(zhì)合成，喹諾酮抑制DNA旋轉(zhuǎn)酶。因此可以在細菌DNA復制及蛋白質(zhì)合成兩個層面上抑制細菌生長，明顯增強除菌效果。

3、支原體去除試劑選擇

      選擇支原體去除試劑需要注意幾個關(guān)鍵幾點：①細胞毒性小，毒性大的試劑在去除支原體的同時，會殺死細胞；②支原體去除效果，選擇廣譜試劑，去除多種支原體，以及細菌，真菌等；③操作簡便，沒有二次污染；要考慮操作使用是否方便，因為如果使用起來比較麻煩，首先是費時費力，另外可能會帶來二次污染。目前市場上有多種支原體去除&預防試劑可選。包括李記生物的Quick Cell支原體預防/去除試劑，美國GenDEPOT公司的Cellmaxin，羅氏公司的BM-Cyclin，Biolnd的BIOMYC-1,BIOMYC-2,BIOMYC-3，以及Invivogen 公司的Plasmocin™ prophylactic和Plasmocin™ treatment 等。

      Quick Cell支原體預防及去除試劑和Cellmaxin都是從蛋白和DNA兩個層面去除支原體，抗菌譜廣。不同在于Quick Cell的使用者可以靈活選擇單獨或聯(lián)合使用兩種成分，分別或同時在蛋白或DNA層面去除支原體污染，細胞毒性更小。作用周期1-2周，支原體去除率大于92%。去除預防兼顧

      BM-Cyclin包含泰妙菌素（BM-Cyclin 1）和二甲胺四環(huán)素（BM-Cyclin 2）兩種成分，抑制支原體及細菌生長，去除培養(yǎng)細胞中已感染的支原體。適用于多種培養(yǎng)細胞，無明顯副作用，又不影響細胞本身的代謝，而且處理過的細胞不會重新感染支原體。BM-Cyclin需聯(lián)合使用，作用周期2周，可消除80%以上的支原體。不確定能否預防。

      BIOMYC-1基于抗生素泰妙菌素，由真菌pleurotus mutilus 產(chǎn)生。 BIOMYC-2基于二甲胺四環(huán)素，四環(huán)素衍生物。此兩種抗生素溶液通常按先后聯(lián)合使用2－3次循環(huán)約一周以上，可取得良好的效果。BIOMYC-3 基于抗生素環(huán)丙沙星，屬于氟喹酮類。許多支原體被證明對BIOMYC-3敏感，需要根據(jù)支原體種類使用。處理周期2周，能去除90%的支原體。是否可以預防支原體目前還不能確定。

       Plasmocin™ prophylactic和Plasmocin™ treatment也是兩種抗生素的混合物，包含兩個針對支原體的有效成分，作用于蛋白質(zhì)合成和DNA復制階段，對許多細菌和真核細胞則沒有影響。作用周期2周，去除效率未知。有兩個濃度包裝，去除用高濃度，預防用低濃度。